En este blog os hago una introducción de mi trabajo de fin de grado, que como indica en el titulo iba sobre el estudio de un gen concretamente de eyegone en el embrión temprano y las ovariolas de Drosophila melanogaster, un organismo modelo del que ya os hable en redes sociales, por lo que si queréis, aunque aquí os lo contaré, en redes estará más en detalle.
Tendréis un apartado de palabras clave siempre, para recordaros los términos importantes.
Palabras clave:
Drosophila melanogaster, eyegone (Eyg), Familia Pax, genes hox, embrión temprano, ovariolas, RNAs, siRNAs, Wild-type (Wt), dFmR1, Aubergine (Aub), Orb, Proteina de heterocromatina 1 (HP1), Histona 3 metilada en la lisina 9 (3mH3K9),GFP, TO-PRO3, cDNA.
Comencemos por el resumen…
Resumen
En este trabajo, se expone el estudio de eyegone (Eyg), siendo este un gen regulador de la
transcripción. En este proyecto se analizó la distribución de eyegone en los ovarios de D.
melanogaster; así como el estudio de la función de eyegone durante el desarrollo de las ovariolas, de este organismo modelo; y el estudio de la posible interacción de eyegone con otros genes involucrados en el desarrollo del oocito. Utilizándose UAS siRNAs, se realizaron mutantes, para analizar eyegone con respecto a dFmR1, Aub y que ocurre en ausencia del propio Eyg; analizando sus resultados mediante métodos cuantitativos (qRT-PCR), de western blot e inmuno-tinciones. Por tanto, los resultados y la discusión profundizan en la idea de la relación de eyegone con dichos genes. Concluyendo que, eyegone, presenta una interacción con dFmR1 y con Aub.
Introducción
Este proyecto, se centrará en el estudio de eyegone (Eyg), que pertenece a la familia de factores de transcripción Pax. Se trata de un conjunto de genes con homeobox, capaces de unir DNA y regular la transcripción de genes subsidiarios del núcleo celular (Aldaz et al., 2003).
La embriogénesis de D. melanogaster, inicia con una serie de divisiones sincronizadas a partir del cigoto, siendo las 10 primeras divisiones sincrónicas y entre el ciclo 11-13 se producen tres divisiones asincrónicas. A partir del ciclo 10, los núcleos comienzan a migrar y posicionarse en la periferia, y en el ciclo 13 se produce una invaginación de la membrana plasmática del huevo para generar células. Hasta este momento, se asume que los RNAs y proteínas necesarios para el desarrollo del embrión tienen una procedencia materna (ver Figura 1) (Ogienko et al., 2007).
Figura 1. Esquemas de la embriogénesis en Drosophila melanogaster (Ogienko et al., 2007). En la embriogénesis representada se observan los estadios embrionarios. Siendo la parte anterior, la que se sitúa a la izquierda y la parte dorsal está en la parte superior en todos los embriones. Reflejando cada esquema una parte de la embriogénesis: A) blastodermo celular, justo después de la ovoposición a 25ºC. B) estado de 3-4 horas tras la ovoposición, donde las células germinales primordiales (PGCs) se adhieren a la invaginación posterior del intestino primordial y migran, junto con el intestino, en la dirección anterodorsal. C) Estado de 4-5 horas tras la ovoposición, donde los PGCs están en una bolsa formada por el intestino primordial. D) Estadio de 5-7 horas tras la ovoposición, con las PGCs migrando a través de la pared del intestino primordial. E) Estadio de 7-9 horas tras la ovoposición, en este punto las PGCs comienzan a adherirse al mesodermo que se encuentra en la parte superior. (F) Estadio de 9-10,5 horas, donde se observa que a medida que la banda germinal se desplaza hacia el polo posterior del embrión, las PGC entran en contacto con el mesodermo, siendo este tejido embrionario el encargado de la formación de las gónadas. G) Estadio 10,5 – 11,5 horas tras la ovoposición, las PGSc se combinan con células mesodérmicas. H) Estadio de 13-14 horas, donde se observan las gónadas combinadas, es decir, las PGCs están rodeadas por células somáticas de origen mesodérmico.
Cuando el embrión pasa a un blastodermo celular, el ciclo celular comienza a alargarse lo suficiente de manera que empieza a haber periodos de G1 que permiten la expresión génica. Esto permite que se vayan generando divisiones cada vez más especializadas, acompañadas de las posiciones que tomarán definitivamente. Esto sucede con las células germinales primordiales, que se posicionan en la parte posterior del animal, gracias a la expresión del plasma germinal, que las ayudará en la especialización para convertirse en células germinales o reproductoras; diferenciadas del resto de células del embrión que serán células somáticas, que se especializarán en diversos tejidos y órganos, con otras funciones (Lasko & Ashburner, 1990).
En cada especie hay un número determinado de células germinales primordiales que durante el desarrollo, formarán los aparatos reproductores y sus componentes. En D. melanogaster, hay 40 células germinales primordiales que se especializan, durante la gastrulación, generando mediante invaginaciones 200 células somáticas que formarán las gónadas femeninas u ovarios, compuestos por las células nurse y oocito, y 100 células de recubrimiento o células foliculares (Ogienko et al., 2007).
Progresivamente, tras la embriogénesis, se produce el ciclo con los distintos estadios larvarios, hasta la mosca adulta. Dentro de la ovariola (ver Figura 2), se encuentran diversos genes de regulación para la maduración sexual: decapentaplegic regula la división y la diferenciación celular; wingless (wg) y hedgehog (hh), son encargados de la regulación somática y mantenimiento del germario (lugar donde se encuentran las ovariolas); por tanto están implicados en la oogénesis (formación de los oocitos) (Ogienko et al., 2007), que se explicará a continuación.
Figura 2. Esquema del aparato reproductor femenino, de las ovariolas maduras de Drosophila melanogaster (Ogienko et al., 2007).
Figura 3. Esquema representativo de la oogénesis de las ovariolas en Drosophila melanogaster, representando el germario (1, 2A/2B, y 3), el estadio 2, el estadio 4, el estadio 6 y el estadio 10. Se puede observar reflejado un centro organizador de microtúbulos (MOC) distintivo en la región posterior del ovocito; siendo la representación de estos microtúbulos de extremos negativos situados en el oocito (OC), mientras sus extremos positivos están en las células nodrizas (NC). El citoesqueleto, se reorganiza completamente en la etapa 10, como se ve en el esquema. (Ogienko et al., 2007).
Los ovarios de D. melanogaster se forman a partir de las células germinales primordiales. En la oogénesis (ver Figura 3), ocurren una serie de divisiones sincrónicas, que dan lugar a 16 células, de donde quince se convertirán en las denominadas células nurse o “células nodrizas”. La célula restante, se convertirá en el ovocito u oocito. La elección de la célula ovocito no es aleatoria, ya que en las divisiones sincrónicas solo 2 de las 16 células tienen estructuras bivalentes en su DNA (en paquitene) y adquieren nódulos de recombinación para la posterior meiosis. En este punto, una de esas dos células regresa a una morfología nuclear similar a las otras 14 células nodrizas, de modo que, el ovocito está determinado (Carpenter, 1979). Dentro de cada ovario, existen 14-16 ovariolas, con células madre en el extremo anterior de la ovariola, y que mediante divisiones asincrónicas, darán lugar a células del germario entre ellas el oocito y a los cistoblastos que se dividen sincrónicamente, hasta las 16 células que dan diferenciación hasta dar la célula oocito (sin procesos de endorreduplicación del DNA), y las demás serán nurse (presentando núcleos con endorreduplicaciones) (Ting Xie & Spradling. 1998).
En este trabajo, se estudiará la función de eyegone en el desarrollo de los ovarios. Eyegone es un factor de transcripción de la familia Paxcon funciones conocidas en el desarrollo del ojo adulto, en la formación de las glándulas salivares y en el desarrollo del tórax de la mosca adulta (Azpiazu & Morata, 1998) (Jih-Guang & Sun, 2005) (Jih-Guang et al., 2008). En todos los casos, se ha visto que actúa como un represor transcripcional. Eyegone es capaz de interaccionar con HP1 (hetreocromatin protein 1) y heterocromatinizar la región enhancer de sus genes diana (Azpiazu & Morata, 1998). HP1 esencial para el silenciamiento de la heterocromatina de los centrómeros y telómeros (Danzer & Wallrath, 2004). La HP1 se asocia con la metil lisina 9 de la histona 3 interactuando con su (var) 3-9 (3mH3K9); normalmente cuando esta se metila en este punto, produce una cromatina silenciada (Motamedi y col., 2008). La cromatina silenciada o heterocromatina es una parte integral de la cromatina y se encuentra en todas las células (Danzer & Wallrath, 2004).
Para estudiar todos los aspectos anteriormente mencionados, se utilizan UAS siRNAs de silenciamiento, que serán las herramientas para generar mutantes y realizar con ellos estudios moleculares, siendo secuencias que controlan la expresión genética. Con hembras vírgenes, con la secuencia de Mat Gal 4 (siendo un dominio secuencia que está determinado en levadura), sabiendo donde se insertan las mutaciones generadas (Chou & Perrimon, 1992) (Vagin, et al., 2006).
En el próximo mes, veremos los objetivos e hipótesis que nos planteamos teniendo en cuenta esto.
Aquí os dejo el artículo final, ya que mi trabajo solo abarco una parte solamente.
Vuestra divulgadora científica con mis cuentas de Ammu Neuroscience and Biology. Artículo de Ana María Morón Usero.Podéis leer más en este glosario de biología.
Gracias por leer. Que la ciencia y la fuerza os acompañe.
ammuneuroscienceandbiology.com 
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