En este blog finalizamos la discusión, conclusiones y agradecimientos. Os hago una introducción del trabajo para que no olvidéis de donde venimos. Este fue mi TFG o trabajo fin de grado, que como indica en el titulo iba sobre el estudio de un gen concretamente de eyegone en el embrión temprano y las ovariolas de Drosophila melanogaster. Tendréis un apartado de palabras clave siempre, para recordaros los términos importantes.Palabras clave:
Drosophila melanogaster, eyegone (Eyg), Familia Pax, genes hox, embrión temprano, ovariolas, RNAs, siRNAs, Wild-type (Wt), dFmR1, Aubergine (Aub), Orb, Proteina de heterocromatina 1 (HP1), Histona 3 metilada en la lisina 9 (3mH3K9),GFP, TO-PRO3, cDNA.Comencemos por el resumen…
Resumen
En este trabajo, se expone el estudio de eyegone (Eyg), siendo este un gen regulador de la
transcripción. En este proyecto se analizó la distribución de eyegone en los ovarios de D.
melanogaster; así como el estudio de la función de eyegone durante el desarrollo de las ovariolas, de este organismo modelo; y el estudio de la posible interacción de eyegone con otros genes involucrados en el desarrollo del oocito. Utilizándose UAS siRNAs, se realizaron mutantes, para analizar eyegone con respecto a dFmR1, Aub y que ocurre en ausencia del propio Eyg; analizando sus resultados mediante métodos cuantitativos (qRT-PCR), de western blot e inmuno-tinciones. Por tanto, los resultados y la discusión profundizan en la idea de la relación de eyegone con dichos genes. Concluyendo que, eyegone, presenta una interacción con dFmR1 y con Aub.
Discusión
En este apartado se analizarán los resultados expuestos previamente. En primer lugar, se utilizó como control, para la observación de la distribución de eyegone en las ovariolas de Drosophila melanogaster, la preparación de anti-GFP. La distribución de GFP, permite conocer el momento del desarrollo en el cual se han expresado los distintos siRNAs para generar las mutaciones. Se ha visto que la expresión de GFP empieza a visualizarse en el germario, lo cual nos indica que la inactivación de los RNAs ocurre temprano en el desarrollo de las ovariolas.
Las tinciones con anti-Orb revelan, que Orb se concentra en el citoplasma del oocito, mientras las anti-Eyg, muestran que Eyegone tiene una expresión citoplásmica más generalizada, aunque en el estadio 2 se puede observar que se concentra también en el citoplasma del oocito (ver Figuras 5 y 6).
Esto podría indicar una interacción entre Orb y Eyg. Esta interacción podría ser funcional, puesto que se observa que en ausencia de Eyg se produce sobre-expresión de Orb.
Por otro lado se han analizado también mutantes de dFmR1 debido a que según estudios previos (Bozzetti et al., 2015), en mutantes para dFmR1, también se observa un aumento en la distribución de Orb en las ovariolas. Sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo muestran como en ausencia de dFmR1, Orb disminuye su expresión. Pudiera ser un fallo de la preparación que no nos haya permitido visualizar la tinción como está descrito.
En los mutantes dFmR1, eyegone se expresa más uniforme, y no se expresa en el estadio 2 en el oocito. Estos resultados podrían sugerir que existe una regulación entre estas moléculas: dFmR1 y Eyegone.
En el mutante Aub, investigado por su interacción con dFmR1, probada en estudios previos (Bozetti et al., 2015), la expresión de Orb es similar al Wt, y la expresión de eyegone es similar a la encontrada en el mutante para dFmR1.
Por último, y como otra evidencia de estas observaciones, se observó que el mutante de Eyg, sobreexpresa Orb, lo que implica que habría que investigar más en una posible interacción entre estos dos genes. Por otro lado, las tinciones con anti-dFmR1 (Figuras 9, 10 y 11), evidencian que dFmR1 se expresa abundantemente en el germario Wt, disminuyendo su expresión a medida que avanza la oogénesis. Sin embargo, en el mutante Eyg se observó que cuando no hay eyegone, dFmR1 se sobreexpresa (se ve también en las qRT-PCRs).
Cuantitativamente, se encuentran evidencias (ver Figura 13), que apoyan estos resultados. La cantidad de RNAs de eyegone en mutantes dFmR1 es menor que el grupo control (< 1), siendo concordante con las preparaciones con anti-Eyg. Mientras, que la cantidad de RNAs de dFmR1 en el mutante eyegone es mayor que el grupo control (> 1).
Con todo lo anteriormente mencionado, se evidencia una interacción entre Eyegone y dFmR1 (ver Figura 14), siendo dFmR1 un regulador de la expresión de Eyegone en el citoplasma, según los resultados obtenidos. Sugerimos que dFmR1 se podría encontrar interactuando con Eyegone, modificando y produciendo la estabilización del RNA de Eyegone según muestra la cuantitativa. La regulación podría ser a nivel de modificación postranscripcional del RNA de Eyegone (ver Figura 15), el cual sería estabilizado tras esta modificación. Si falta dFmR1, Eyg se desestabiliza y es llevado a degradación.
El hecho de que en los mutantes de Eyg, dFmR1 esté aumentado sugiere que Eyg regula los niveles de RNA de dFmR1 de manera contraria a como lo hace dFmR1 con Eyg. En este caso, existiría una interacción entre Eyg y el RNA de dFmR1 que desestabilizaría estos RNAs para llevarlos a degradación. En ausencia de Eyg, los RNAs de dFmR1 no serían degradados, y de ahí el aumento en la expresión observado tanto a nivel de RNA como en las tinciones.
Figura 14. Modelo de la interacción citoplasmática de Eyegone y dFmR1.
Figura 15. Modelo de Eyg y dFmR1. Presentándose dFmR1 como estabilizador o como degradador de Eyg, sino interacciona con este.
Figura 16. Modelo de interacción entre Aub, dFmR1 y Eyegone, con piRNA en los nauges bodies.
Para acabar, el análisis de las tinciones de anti-HP1 y la anti-3mH3K9, permite analizar el estado de la heterocromatina. En todas las mutaciones analizadas la morfología del DNA es anormal, como muestra el canal de TO-PRO3. La tinción de HP1, muestra menos acumulación de la proteína en los núcleos de los mutantes y 3mH3K9 aparece también con menor expresión, siendo además similares los silenciamientos en todos los mutantes, aunque especialmente entre los de dFmR1 y Eyg. Por último, cabe destacar la morfología aberrante de la cromatinas de los mutantes presentándose desorganizadas.
Esto mismo ocurre en los mutantes para Aubergine (Aub), una proteina que forma parte de la ruta de los piRNAs (Ishizu et al., 2012) y que se ha asociado con dFmR1 (Bozetti et al., 2015). La interacción de dFmR1 y Aub, se produce en el citoplasma; de igual forma según el modelo anterior que se planteó en la Figura 14, dFmR1 interacciona con Eyegone, también en el citoplasma, siendo capaz de estabilizarlo.
Por otro lado, se sabe que Aub está formando parte del complejo de silenciamiento mediado por piRNAs (Ishizu et al., 2012). Como Aub y dFmR1 interaccionan en el citoplasma, podría ser que se asociaran las tres (Aub, dFmR1 y Eyg) (ver Figura 16), y tuvieran una nueva función en la generación de los piRNAs que son capaces de silenciar la cromatina. De esta manera, la ausencia de cualquiera de las tres proteínas daría un fenotipo de falta de silenciamiento y malformación de la heterocromatina que sería lo que se observa en las tinciones con TO-PRO3. Este complejo, no había sido descrito hasta ahora, y precisaría de más estudios para conocer exactamente cómo funciona.
Por último, los análisis de los Western blot, evidencian la presencia de Eyegone en los núcleos de embriones. Esta expresión nuclear sería la descrita anteriormente (Aldaz et al., 2003). Sin embargo, por tinciones y western blot se detecta además una distribución citoplásmica de Eyg que no ha sido descrita hasta la fecha. La proteina nuclear y la citoplásmica corren en el gel con diferente movilidad sugiriendo que existen diferencias entre ambas. Una posible explicación a esta diferencia, sería una modificación postraduccional de la proteina que favoreciera su entrada al núcleo o la mantuviera en el citoplasma.
Conclusiones
Concluimos que Eyegone y dFmR1, presentan interacciones complejas que generan regulaciones entre ellas en los estadios de la oogénesis de Drosophila. En ausencia de eyegone se observa la expansión de la expresión de dFmR1; en ausencia de dFmR1, eyegone se desestabiliza.
También se concluye que Aub está interaccionando con dFmR1, ya que cuando hay más expresión de dFmR1 se observa que Aub disminuye su expresión, y viceversa (Bozetti et al., 2001). Por tanto, junto con las observaciones realizadas en este proyecto, en las que Aub presenta dFmR1 homogéneo, y ocurría lo mismo con Eyegone; se puede concluir que Eyegone y Aub, parecen tener interacciones, ya que según las evidencias de este trabajo Eyegone y dFmR1 son muy similares en expresión, dentro del mutante Aub. Por tanto, existe interacción entre Aub, Eyg y dFmR1, en un complejo, hasta ahora no descrito. Esta interacción además podría ser parte del complejo de generación de piRNAs en el ovario de Drosophila.
Bibliografía:
- Adelaide T. C. Carpenter. 1979. Synaptonemal complez and recombination nodules in wild-type Drosophila melanogaster females Genetics. 92. 511-541. A.Ogienko, S. A. Fedorova, and E. M. Baricheva. 2007. Basic Aspects of Ovarian Development in Drosophila melanogaster. Russian Journal of Genetics. 43. 1120–1134.
- Alicia Y. Franco y Marinés Longart. 2009. Aplicaciones de la proteina verde fluorescente (GFP) en la biología celular y en la visualización del sistema nervioso. Revista de Estudios Transdisciplinarios. 1.85-96.
- Andrea H. Brand and Norbert Perrimon. 1993. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118. 401-415.
- A. Welsh Claude, Daniel Cochran, Harold Erk, Frank Mayer, William Shaver, John Al Sair Abdalá. 1964. Ciencias Biológicas: De las Moléculas al Hombre. Editorial Continental. 1. 1-980.
- Chuen- Chuen Jang, Ju-Lan Chao, Nikolas Jones, Li-Chin Yao, Dmitri A. Bessarab, Yien M. Kuo, Susie Jun, Claude Desplan, Steven K. Beckendorf and Y. Henry Sun. 2003. Two Pax genes, eyegone and eyeless, act cooperatively in promoting Drosophila eye development. Development. 130. 2939- 2951.
- Hirotsugu Ishizu, Haruhiko Siomi, and Mikiko C. Siomi. 2012. Biology of PIWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of germlines. Genes & Development. 26. 2361–2373.
- Jih-Guang Yao and Y. Henry Sun. 2005. Eyg and Ey Pax proteins act by distinct transcriptional mechanisms in Drosophila development. The EMBO Journal. 24. 2602–2612.
- Jih-Guang Yao, Bonnie M. Weasner, Lan-Hsin Wang, Chuen-Chuen Jang, Brandon Weasner, Chiou- Yang Tang, Claire L. Salzer, Chun-Hong Chen, Bruce Hay, Y. Henry Sun, and Justin P. Kumar. 2008. Differential Requirements for the Pax6(5a) Genes eyegone and twin of eyegone During Eye Development in Drosophila. Dev Biol. 315. 535–551.
- John R. Danzer and Lori L. Wallrath. 2004. Mechanisms of HP1-mediated gene silencing in Drosophila. Development. 131. 3571-3580.
- Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT Method. METHODS. 25. 402–408.
- Maria Pia Bozzetti, Valeria Specchia, Pierre B. Cattenoz, Pietro Laneve, Annamaria Geusa, H. Bahar Sahin, Silvia Di Tommaso, Antonella Friscini, Serafina Massari, Celine Diebold and Angela Giangrande. 2015. The Drosophila fragile X mental retardation protein participates in the piRNA pathway. Journal of Cell Science. 128. 2070-2084.
- Mohammad R. Motamedi, Eun-Jin Erica Hong, Xue Li, Scott Gerber, Carilee Denison, Steven Gygi, and Danesh Moazed. 2008. HP1 Proteins Form Distinct Complexes and Mediate Heterochromatic Gene Silencing. Molecular Cell. 32. 778–790.
- Natalia Azpiazu and Ginés Morata. 1998. Functional and regulatory interactions between Hox and extradenticle genes. Genes & Development. 12. 261–273.
- Silvia Aldaz, Ginés Morata and Natalia Azpiazu. 2003. The Pax-homeobox gene eyegone is involved in the subdivision of the thorax of Drosophila. Development. 130. 4473-4482.
- Ting Xie and Allan C. Spradling. 1998. Decapentaplegic Is Essential for the Maintenance and Division of Germline Stem Cells in the Drosophila Ovary. Cell. 94. 251-260.
- Richard Benton and Daniel St. Johnston. 2002. Cell Polarity: Posterior Par-1 Prevents Proteolysis.
- Current Biology. 12. 479–481.
- Tze-Bin Chou and Norbert Perrimon. 1992. Use of a Yeast Sitespecific Recombinase to Produce Female Germline Chimeras in Drosophila. Genetics. 131. 643-653.
- Vasily V. Vagin, et al. 2006. A Distinct Small RNA Pathway Silences Selfish Genetic Elements in the Germline. Science. 313. 320-324.
AgradecimientosQuisiera agradecer a todo el laboratorio de Ginés Morata y de Ernesto Sánchez-Herrero, por su calidad profesional y aún más humana. Especialmente, quiero agradecer a la tutora profesional, Natalia Azpiazu, en su dedicación y paciencia con alguien que está aprendiendo, buscando juntos respuestas ante las hipótesis y los fallos. Por supuesto, a la tutora profesional Isabel Molina, por su esfuerzo y tiempo, ayudando en este proyecto. Por último, a Lucía Moreda, Abraham García López y Ana Lorenzo Barrio alumnos en prácticas por su aprendizaje, por su enseñanza y por su ayuda en los experimentos de este proyecto.
Aquí os dejo el artículo final, ya que mi trabajo solo abarco una parte solamente. Lamento las imágenes, mi yo del 2016 – 2017 no sabía que aprendería tanto de edición.
Vuestra divulgadora científica con mis cuentas de Ammu Neuroscience and Biology. Artículo de Ana María Morón Usero.Podéis leer más en este glosario de biología.
Gracias por leer. Que la ciencia y la fuerza os acompañe.
ammuneuroscienceandbiology.com 
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