Tras los dos meses donde hemos introducido el trabajo, hipótesis, objetivos y cómo se hizo (materiales y métodos), ya toca ver que obtuvimos en los resultados.
Para ello, os recuerdo las palabras clave y el resumen del trabajo:
Palabras clave
Drosophila melanogaster, eyegone (Eyg), Familia Pax, genes hox, embrión temprano, ovariolas, RNAs, siRNAs, Wild-type (Wt), dFmR1, Aubergine (Aub), Orb, Proteina de heterocromatina 1 (HP1), Histona 3 metilada en la lisina 9 (3mH3K9),GFP, TO-PRO3, cDNA.
Resumen
En este trabajo, se expone el estudio de eyegone (Eyg), siendo este un gen regulador de la
transcripción. En este proyecto se analizó la distribución de eyegone en los ovarios de D.
melanogaster; así como el estudio de la función de eyegone durante el desarrollo de las ovariolas, de este organismo modelo; y el estudio de la posible interacción de eyegone con otros genes involucrados en el desarrollo del oocito. Utilizándose UAS siRNAs, se realizaron mutantes, para analizar eyegone con respecto a dFmR1, Aub y que ocurre en ausencia del propio Eyg; analizando sus resultados mediante métodos cuantitativos (qRT-PCR), de western blot e inmuno-tinciones. Por tanto, los resultados y la discusión profundizan en la idea de la relación de eyegone con dichos genes. Concluyendo que, eyegone, presenta una interacción con dFmR1 y con Aub.
Resultados
A continuación, se exponen los resultados de los distintos experimentos explicados en al apartado anterior:
1. Resultados de las preparaciones de inmuno-tinción de ovariolas:
Este apartado, se encuentra subdividido en 4 puntos según las inmuno-tinciones realizadas en las ovariolas de D. melanogaster. Siempre presentando el grupo control o wild-type (Wt), y posteriormente los diferentes mutantes (dFmR1, Aub y Eyg). Las preparaciones se realizaron como ya se detalló en el apartado de material y métodos, con los diferentes anticuerpos. Cabe destacar que el núcleo del oocito siempre aparece redondeado u ovalado, y marcado con una flecha; así mismo, el canal de TO-PRO3 (TOPRO en las figuras, teñido de color azul) marca el DNA de los núcleos.
1.1 Resultados de la inmuno-tinción de ovariolas MatGal4/UAS GFP con anti-GFP:
En esta preparación se observa, la distribución del GFP, que sirve como control para saber dónde se está silenciando los genes durante el desarrollo del oocito.
Se observa (ver Figura 4), como en el estadio germario GFP se expresa de modo general en todos los núcleos celulares. En el estadio 4 de los cistos, se puede observar que la concentración de GFP se da en todos los núcleos, pero que se expresa especialmente entorno al núcleo del oocito, presentando una mayor intensidad (oocito señalado con una flecha). En el estadio 6, la expresión de GFP se observa que empieza a centrarse más en el oocito, mientras disminuye su expresión en el resto de núcleos. Por tanto, se observa que la expresión de GFP es general y temprana durante el desarrollo de las ovariolas.
Figura 4. Estadios de las ovariolas con anti- GFP (0-25 micras). Se observa de (a-c) el germario y estadio 2 (d-f) el estadio 4, y de (g-i) el estadio 6.
1.2 Resultados de la inmuno-tinción de ovariolas con anti-Orb y anti-Eyg:
En las siguientes figuras, se pueden observar los distintos estadios de la oogénesis teñidos con anti-Orb y anti-Eyg siendo Orb el anticuerpo control, que indica dónde se encuentra el oocito, ya que Orb se expresa especialmente en el citoplasma del núcleo del oocito. Por ello, estudiar cómo se distribuye Eyegone en el grupo control y con cada una de las mutaciones producidas, en cada estadio, nos aportará información de las funciones de eyegone en el desarrollo de las Drosophila.
En el caso de Wt (ver Figura 5), se observan en el germario y el estadio 2, que Orb (teñido en verde) aparece en el citoplasma de los cistos en división y en el citoplasma del futuro oocito, como se indica con las flechas, a partir del estadio 2. Por el contrario, Eyegone (teñido en color rojo) se encuentra en los citoplasmas de todas las células, aunque concentrándose también en el núcleo del oocito del estadio 2.
En el mutante de dFmR1, se observa la expresión de Orb y Eyg siendo menores (está descrito que Orb en el mutante dFmR1 está extendido) sus expresiones que el Wt, pero con acumulación igualmente en el citoplasma del oocito del estadio 2.
Figura 5. Estadio germario y estadio 2 del grupo control Wt y de los mutantes (dFmR1, Aub, y Eyg), en tinciones con anti-Orb y anti-Eyg (0-25 micras). Se observa de (a-d) el germario y estadio 2 de Wt, de (e-h) el germario y estadio 2 de dFmR1, de (i-l) el germario y estadio 2 de Aub, de (m-o) el germario y estadio 2 de Eyg.
En el mutante de Aub, se observa que Orb se expresa como en el grupo control, con la acumulación característica del citoplasma del oocito en el estadio 2, pero Eyegone se expresa de modo uniforme sin acumulación característica en el citoplasma del oocito del estadio 2, como ocurría en los dos casos anteriores.
Por último, en el mutante Eyg no hay Eyegone, mientras que la expresión de Orb se extiende, siendo uniforme en todo el germario y estadio 2. Por otro lado, a medida que se avanza el desarrollo de las ovariolas de Drosophila, (ver Figura 6), se observa en el Wt en el estadio 4 mantiene el patrón de Orb expresándose en el citoplasma del oocito, Eyegone se distribuye en el citoplasma de las células pero deja de concentrarse en el oocito, como si ocurría en los primeros estadios.
En el mutante dFmR1, la expresión de Eyegone se observa también, en el citoplasma del oocito en el estadio 2 y se mantiene a más altos niveles que el Wt en estadio 4; Orb se sobre-expresa, centrándose en el oocito. En el mutante Aub, Orb se localiza como el grupo control, y Eyegone prácticamente se expresa uniformemente como ocurría en el estadio 2, con acumulaciones destacadas en el citoplasma del oocito, siendo igual en todo el estadio 4.
Por último, en el mutante Eyg, se expresa Orb se acumula alrededor de los núcleos de las células nodrizas, cosa que no ocurre en el Wt, mientras Eyegone se encuentra ausente.
Figura 6. Estadio 4 con anti-Orb y anti-Eyg en el grupo control (Wt) y de los mutantes (dFmR1, Aub, y Eyg) (0-25 micras). Se observa de (a-d) el estadio 4 de Wt, de (e-h) el estadio 4 de dFmR1, de (i-l) el estadio 4 de Aub, y de (m-o) el estadio 4 de Eyg.
1.3 Resultados de la inmuno-tinción en ovariolas de anti-HP1 y anti-3mH3K9:
En estas figuras, se observa también una morfología aberrante del DNA de las nurse cells en estadios 2 y 4. Para analizar el estado de la cromatina en esos cistos, se emplean anticuerpos contra HP1 (teñido de color verde) y 3mH3K9 (teñido de color rojo). Sabiendo que HP1 y 3mH3K9, están asociadas con el silenciamiento de la heterocromatina, se observan cómo se distribuyen en los núcleos. La inmunotinción con anti-HP1 muestra una acumulación más pronunciada de la proteína en el oocito al igual que ocurre con la marca anti- 3mH3K9. En el germario de Wt (ver Figura 7), la distribución de HP1 y 3mH3K9 es más homogénea; pero en el estadio 2 se puede empezar a observar a mayor aumento esa acumulación en el oocito.
Figura 7. Germario y estadio 2 con anti-HP1 y anti-3mH3K9 en el grupo control (Wt) y de los mutantes (dFmR1, Aub, y Eyg) (0-25 micras). Se observa de (a-d) el germario de Wt, de (e-h) el estadio 2 de Wt, de (i-l) el germario y estadio 2 de dFmR1, de (m-p) el germario y estadio 2 de Aub; y de (q-t) el germario y estadio 2 de Eyg.
En el germario y el estadio 2 del mutante dFmR1, se observa que hay una expresión de HP1 y 3mH3K9, menor que en el Wt, siendo su expresión menor también según avanza en el desarrollo. En el mutante Aub, se observa sobre-expresión de la HP1 en el germario, y concentrándose especialmente en el oocito, en el estadio 2; mientras 3mH3K9, se distribuye homogéneamente en ambos estadios.
Por último, en el mutante de Eyg, se observa una expresión de HP1 en el núcleo de las células, especialmente del oocito; mientras la 3mH3K9 se expresa en los núcleos del germario y del estadio 2 en puntos concretos. La expresión en el oocito en el estadio 2, es bastante fuerte y similar al mutante dFmR1.
En el estadio 4 del grupo Wt, se observa la concentración de la expresión de HP1 en el núcleo del oocito (ver Figura 8); mientras la 3mH3K9, aumenta su expresión en los citoplasmas.
En el caso del mutante dFmR1, se observa la elevada expresión de HP1 en el oocito, comparado con los otros núcleos que también la presentan, y la 3mH3K9, también se concentra en el oocito, principalmente, pero en un área concreta, y presenta puntos dispersos por los núcleos de las células nodrizas donde se expresa.
Figura 8. Estadio 4 con anti-HP1 y anti-3mH3K9 en el grupo control (Wt) y de los mutantes (dFmR1, Aub, y Eyg) (0-25 micras). Se observa de (a-d) el estadio 4 de Wt, de (e-h) el estadio 4 de de dFmR1, de (i-l) el estadio 4 de Aub, de (m-p) el estadio 4 de Eyg.
En el caso del mutante de Aub, se observa la sobre-expresión de HP1, expresada especialmente en el núcleo del oocito, mientras se expresa también en el resto de núcleos con mayor expresión respecto del Wt, mientras la 3mH3K9, se expresa homogénea y similar al Wt. Por último, en el mutante de Eyg, se observa la sobreexpresión de HP1 en el núcleo del oocito, y la expresión en los núcleos de las células nodrizas; mientras 3mH3K9 se expresa en la periferia (las células foliculares) y en una región del núcleo del oocito, siendo muy similares entre sí estos mutantes y los dFmR1. Por tanto, según avanza el desarrollo, la 3mH3K9 debería de disminuir su expresión, y la HP1 concentrarse especialmente en el núcleo del oocito. Se puede concluir que en los mutantes esta distribución está alterada, sugiriendo alteraciones en la formación de la heterocromatina (ver canal TO-PRO3).
1.4 Resultados de la inmuno-tinción con anti-dFmR1:
En estas figuras, se tiñen al grupo control y los mutantes de Aub y Eyg, y se analiza el germario, el estadio 2 y el estadio 4 (ver Figura 8, 9 y 10 respectivamente). En el estadio del germario (ver Figura 9), en el caso de Wt, se observa la expresión abundante de dFmR1 (teñida de color verde) en los citoplasmas celulares, no habiendo acumulación dentro del núcleo. En el caso del mutante Aub, se observa en el germario la baja expresión de dFmR1 en el germario, nuevamente sin acumulación en ningún núcleo. En el caso de los mutantes para Eyg, se observa sobre-expresión de dFmR1, en todo el germario, acumulándose en los citoplasmas de todas las células.
Figura 9. Germario con anti-dFmR1 en el grupo control (Wt) y de los mutantes (Aub y Eyg) (0-25 micras). Se observa de (a-c) el germario de Wt, de (g-i) el germario de Aub, de (m-o) el germario de Eyg.
En el estadio 2 (ver Figura 10), en el Wt se observa la expresión de dFmR1 concentrada en el citoplasma del oocito, similar a la distribución de Eyegone en el Wt. En el mutante Aub, la expresión de dFmR1 se observa homogénea y sin puntos de acumulación citoplasmáticos. En el mutante Eyg, se observa la sobre-expresión de dFmR1 en el estadio 2, siendo destacado el acumulo de dFmR1, en el citoplasma del oocito.
Figura 10. Estadio 2 con anti-dFmR1 en el grupo control (Wt) y de los mutantes (Aub y Eyg). Se observa de (d-f) el germario de Wt, de (j-l) el germario de Aub, de (p-r) el germario de Eyg.
En el estadio 6 con anti-dFmR1 (ver Figura 11), se observa el aumento de expresión en el grupo control o Wt, a medida que avanza el desarrollo, pero dFmR1 se mantiene distribuido homogéneamente en los citoplasmas de todas las células, como en los estadios primarios. En el mutante Aub, se observa la distribución homogénea de dFmR1 en todos los citoplasmas, siendo su distribución muy similar al Wt. En el mutante Eyg, se observa a dFmR1 sobre- expresado en el citoplasma del oocito y de las células nodrizas.
Figura 11. Estadio 6 con anti-dFmR1 en el grupo control (Wt) y de los mutantes (Aub, y Eyg) (0-25micras). Se observa de (a-c) el estadio 6 de Wt, de (j-l) el estadio 6 de Aub, de (p-r) el estadio 6 de Eyg.
2. Resultados de las PCR y qRT-PCR:
En los análisis de qRT-PCR se han analizado los niveles relativos de distintos RNAs en los mutantes respecto al control Wt. Se han usado dos tipos de primers; unos específicos para el RNA de eyg y otros para el RNA de dFmR1. En la gráfica se muestran los resultados obtenidos (ver Figura 12), de modo cuantitativo. Como control de carga se usan unos primers que amplifican el RNA de la actina, que no se espera que esté modificado en los mutantes. En los distintos mutantes se va a analizar la variación de los niveles de los RNAs de eyegone y de dFmR1 con respecto a los Wt. Se observa que en el mutante dFmR1 los niveles de eyg aparecen por debajo del Wt, siendo < 1. Por otro lado, como cabía esperar en los mutantes eyegone la cantidad de RNA de eyegone está muy por debajo del Wt. Los niveles de RNA de dFmR1 están por debajo del Wt en los mutantes de dFmR1. Por el contrario, en los mutantes para Eyg se observa un aumento significativo en los niveles de RNA.
Figura 12. Gráfica de análisis de cuantificación de RNAs, con primers de eyegone (en rojo), y primers dedFmR1 (en azul). Representando los valores del modelo de Livak (en el eje Y), y los distintos mutantes ygrupo control (Wt) (en el eje X).
3. Resultados del Western blot:
En este apartado se pueden observar experimentos de Western blot con anti-Eyg, realizados en este trabajo. No se ha conseguido determinar con exactitud la cantidad necesaria de ovarios necesarios para la extracción de proteínas, que nos permitan visualizar eyegone en el núcleo de las ovariolas. Todos los ensayos hechos no han mostrado señal apreciable de Eyg, en los núcleos. Por otro lado, para embriones se determinó que la cantidad necesaria son 100 microlitros de embriones tempranos. El resultado del western blot hecho con ovarios y embriones (se muestra en la Figura 13). Eyegone aparece en embriones tempranos en los núcleos, pero no en el citoplasma. En los núcleos de los ovarios (carril 4 núcleos), tal y como se ha comentado no se detecta señal, pero en el carril 5 se observa en los citoplasmas de ovarios la presencia de una banda a diferente altura que la observada en embriones (ver flecha indicativa).
Figura 13. Western Blot de embriones Wt con anti Eyg, resultado positivo.
En el próximo mes, veremos los la discusión de estos datos y resultados. Con su bibliografía para cerrar este trabajo.
Aquí os dejo el artículo final, ya que mi trabajo solo abarco una parte solamente.
Espero que os haya gustado.
Que la ciencia y la fuerza os acompañe.
Ammu. Ana María Morón Usero.
ammuneuroscienceandbiology.com 
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